Wichtige Fortschritte bei Next-Generation-Tools zur Genomeditierung für die Huntington-Krankheit

In den letzten Tagen gab es eine Flut von Nachrichten über den Einsatz der sogenannten Genomeditierung als potenzielle Therapie für genetische Erkrankungen wie die Huntington-Krankheit. Diese Ansätze, zu denen exotisch klingende Werkzeuge wie Zinkfinger-Nukleasen und CRISPR/Cas9 gehören, unterscheiden sich von traditionelleren Methoden, die die Auswirkungen der HD-Mutation auf Zellen reduzieren. Was gibt es Neues in diesem spannenden Forschungsbereich?

Auffrischung zum Thema Huntingtin-Senkung

In letzter Zeit gab es große Aufregung um die Weiterentwicklung einer neuen Huntingtin-senkenden, manchmal auch Gen-Stilllegung genannten Behandlung der Huntington-Krankheit. Das erste dieser Medikamente, das in klinischen Studien am Menschen bei HD eingesetzt wird, sogenannte Antisense-Oligonukleotide (ASO’s), reduzieren die Menge des schädlichen mutierten Huntingtin-Proteins, das von einer Zelle produziert wird, und begrenzen letztendlich den Schaden, den es verursachen kann.

Diejenigen, die mitverfolgt haben, wissen, dass die erste Studie zur Bewertung der Sicherheit von ASO’s bei menschlichen HD-Patienten derzeit läuft (http://en.hdbuzz.net/204), aber einige Leser erinnern sich vielleicht auch daran, dass ASO’s nicht der einzige Akteur sind, wenn es um innovative Wege zur Reduzierung des schädlichen Huntingtin-Proteins geht.

Tatsächlich haben zwei weitere neue therapeutische Techniken, die als Zinkfinger-Nukleasen und CRISPR bekannt sind, in letzter Zeit für Aufsehen gesorgt. Obwohl wir beide Ansätze bereits behandelt haben (http://en.hdbuzz.net/023), wird eine kurze Überprüfung ihrer Funktionsweise und der Unterschiede zwischen ihnen hilfreich sein, um einige neue Erkenntnisse zu verstehen.

Sie erinnern sich wahrscheinlich aus Ihrem frühesten Biologieunterricht daran, dass Ihre DNA einen detaillierten Satz von Anweisungen dafür liefert, wie man, nun ja, Sie baut! Jede Zelle in Ihrem Körper ist wie eine Baustelle, und Ihre DNA ist die Master-Blaupause mit Anweisungen, wie man die einfachsten Bausteine (Aminosäuren genannt) nimmt und sie in funktionierende Proteine verwandelt, die zu all Ihren einzigartigen Merkmalen beitragen und sicherstellen, dass die Dinge in Ihrem Körper weiterhin reibungslos ablaufen.

Wir nennen die DNA-Anweisungen zum Aufbau spezifischer Proteine Gene, und wir haben jeweils zwei Kopien des Gens zur Herstellung eines wichtigen Proteins, das Huntingtin genannt wird. Die mit der Huntington-Krankheit verbundenen Symptome treten auf, weil eine dieser genetischen Anweisungen einen Druckfehler entwickelt hat, der dazu führt, dass das Huntingtin-Protein fehlerhaft aufgebaut wird. In der überwiegenden Mehrheit der HD-Patienten führt dies zu zwei Arten von Huntingtin-Protein – einem mutierten Huntingtin-Protein, das nicht mehr richtig funktioniert, und einem gesunden Huntingtin-Protein, das dies tut.

Lasst uns mit dem Bauen beginnen…

In jeder der Zellen in Ihrem Körper wird Ihre DNA tief an einem Ort namens Zellkern gespeichert und geschützt, ähnlich wie die Master-Blaupause für ein Gebäude, die vom Bauleiter in ihrem Büro eingeschlossen wurde, um zu verhindern, dass sie beschädigt wird.

Auf einer echten Baustelle wäre es sehr langsam und ineffizient, wenn jeder Arbeiter in das Büro des Bauleiters gehen müsste, um bei der Konstruktion denselben Satz von Anweisungen zu verwenden, und wie sich herausstellt, gilt das Gleiche auch für unsere Zellen.

Um dieses Problem zu vermeiden, wird eine Arbeitskopie der Anweisungen erstellt, die stattdessen als Vorlage für den Aufbau von Proteinen verwendet wird. Diese Arbeitskopie wird als Boten-RNA oder mRNA bezeichnet, und sie wird von der ursprünglichen DNA kopiert und in die Zelle geschickt, wo sie verwendet wird, um viele Kopien desselben Proteins in größerem Maßstab zu erstellen.

Wenn unsere DNA wie die ursprüngliche Master-Blaupause ist, dann ist mRNA wie die einzelnen Kopien der Blaupause, die vom Bauleiter an seine Crew geliefert werden, damit diese effizient mit dem Bau beginnen kann. Das mag verwirrend erscheinen, aber für unsere Zwecke müssen Sie nur die drei Schritte kennen, die am Aufbau eines Proteins beteiligt sind: DNA -> mRNA -> Protein.

ASO’s, Zinkfinger & CRISPR: Dasselbe Ziel, unterschiedliche Mittel

Es ist wichtig, zwischen dem HD-Gen in der DNA und in der mRNA zu unterscheiden, da sie unterschiedlich von sich schnell entwickelnden Huntingtin-senkenden Therapien angegriffen werden. Dazu gehört ein Zoo verschiedener Techniken wie ASO’s, Zinkfinger und ein neuer Ansatz namens CRISPR/Cas9. Im Kern haben alle diese therapeutischen Techniken dasselbe Ziel vor Augen – die Menge des schädlichen mutierten Huntingtin-Proteins, das in einer Zelle produziert wird, zu reduzieren – aber sie erreichen dieses Ziel auf sehr unterschiedliche Weise.

Von den drei Optionen gibt es ASO’s am längsten, was Sie vielleicht nicht überraschen wird, da sie sich als die ersten herausgestellt haben, die an menschlichen HD-Patienten untersucht werden. ASO’s wirken, indem sie den Zellen sagen, sie sollen den Boten erschießen, in diesem Fall das mRNA-Intermediat, das die Anweisungen von der DNA zur Herstellung eines Proteins trägt. In einer behandelten Zelle haften ASO-Medikamente buchstäblich an der mRNA, die die Anweisungen zur Herstellung des schädlichen mutierten Huntingtin-Proteins liefert, und überzeugen die Zelle, es zu zerhacken, so dass das Protein nicht mehr produziert werden kann.

Viele Wissenschaftler und Mitglieder der HD-Community sind sehr begeistert von der Weiterentwicklung der ASO-Therapie als Behandlungsoption für HD, aber es bleibt die Tatsache, dass die ASO-Therapie nicht die eigentliche Ursache von HD (das fehlerhafte HD-Gen, das in der DNA einer Person kodiert ist) angreift und einen Schritt entfernt bleibt, indem sie auf die mRNA abzielt. Da das mutierte Gen immer noch in der DNA vorhanden ist, würden mutierte mRNA und Protein weiterhin in ASO-behandelten Zellen produziert werden. Das bedeutet, soweit wir es heute verstehen, dass die Behandlung mit ASOs lebenslang fortgesetzt werden müsste.

Im Gegensatz zur Huntingtin-Senkung mit ASO’s sind neuere Techniken wie Zinkfinger-Nukleasen und CRISPR/Cas9 beides Formen von Genomeditierungstechniken. Diese erstaunlichen neuen Werkzeuge ermöglichen es Wissenschaftlern, die eigentliche Ursache des Problems bei HD, die mutierte DNA selbst, anzugreifen. Diese Werkzeuge ermöglichen es Wissenschaftlern, präzise einen bestimmten Ort in der DNA anzuvisieren (wie die Anweisungen zur Herstellung des Huntingtin-Proteins) und dann eine Reihe nützlicher Tricks auszuführen.

Einer dieser Tricks, die sie anwenden können, ist, als eine Art Stoppschild für die Zelle zu dienen. Wenn die Maschinerie, die normalerweise DNA liest, am mutierten HD-Gen ankommt, können entsprechend entwickelte Genomeditierungswerkzeuge sie abrufen und ihnen sagen, sie sollen ihre Arbeit an diesem präzisen Gen nicht ausführen. Dies führt dazu, dass niemals mutierte Huntingtin-mRNA oder Protein hergestellt werden. Beachten Sie, dass dies anders ist als die Funktionsweise von ASOs, die mRNA abbauen, die bereits hergestellt wurde.

Ein wichtiges neues Genomeditierungswerkzeug namens CRISPR/Cas9 hat in letzter Zeit viele Menschen sehr begeistert. Diese Werkzeuge, die von bestimmten Bakterienarten entlehnt wurden, die sie als eine Art Immunsystem verwenden, ermöglichen es Zellen, fremde DNA-Sequenzen in ihre eigene DNA einzufügen. Wirklich clevere Menschen nahmen diese Werkzeuge von Bakterien und entwickelten sie so um, dass Wissenschaftler präzise Schnitte in die DNA an bestimmten Sequenzen machen können.

Theoretisch und im Labor können CRISPR-Techniken verwendet werden, um spezifische DNA-Sequenzen zu schneiden, so dass die Zelle ein Gen nicht mehr lesen kann. Sie können auch verwendet werden, um Zellen anzuweisen, spezifische Änderungen an DNA-Sequenzen vorzunehmen – sogar, theoretisch, Mutationen wie die, die HD verursachen, zu reparieren. Das Anvisieren der Ursache von HD an ihrer Wurzel (dem HD-Gen) würde sicherstellen, dass sowohl die mutierte Huntingtin-mRNA als auch das mutierte Huntingtin-Protein nicht mehr hergestellt werden und keinen Schaden mehr anrichten können.

Sicherheit geht vor!

Wenn Sie sich fragen, warum wir diese neuen Werkzeuge noch nicht als Medikamente testen, liegt das daran, dass viele Dinge in der Medikamentenentwicklung passieren müssen, um sicherzustellen, dass das Endprodukt sowohl sicher als auch wirksam ist, bevor es an HD-Patienten getestet werden kann.

Zuerst müssen Wissenschaftler herausfinden, wie sie diese Medikamente in das Gehirn bekommen, wo das mutierte Huntingtin-Protein den größten Teil seines Schadens anrichtet. Das ist schwierig – unser Gehirn ist besonders gut darin, Dinge fernzuhalten, die schädlich sein könnten, und leider wird es diesen Medikamenten keine freie Fahrt gewähren. Wenn wir versuchen würden, sie in eine Pille zu stecken oder sie in unser Blut zu injizieren, würden unsere Körper sie abbauen und sie lange bevor sie das Gehirn erreichen, nutzlos machen.

Da ASO’s schon etwas länger existieren, hatten Wissenschaftler etwas mehr Zeit, um dieses Problem anzugehen, obwohl ihre Lösung noch lange nicht perfekt ist. Die ASOs, die in der menschlichen HD-Studie verwendet werden, müssen in die Flüssigkeit injiziert werden, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt, die Zerebrospinalflüssigkeit. Wir haben allen Grund zu der Annahme, dass dies funktionieren wird, aber es ist offensichtlich komplizierter als nur eine Pille zu schlucken.

Genomeditierungswerkzeuge wie CRISPR und Zinkfinger sind noch komplizierter zu verabreichen als ihre ASO-Pendants. Das liegt daran, dass sie eigentlich selbst Proteine sind, und diese sind schwer intakt in Zellen zu verabreichen.

Um dieses Problem zu umgehen, verwenden Forscher harmlose Viren, um die DNA-Anweisungen zur Herstellung dieser Proteine in Gehirnzellen einzuschleusen. Von dort aus werden Zellen dazu verleitet, dieselbe Maschinerie zu verwenden, die sie zum Aufbau ihrer eigenen Proteine verwenden, um Genomeditierungswerkzeuge zu bauen, wodurch Zellen im Wesentlichen in Fabriken für ihre eigenen Medikamente verwandelt werden!

Was gibt es Neues bei Zinkfingern für HD?

Da viele Forschungsteams keine Herausforderung scheuen, haben sie hart daran gearbeitet, die zuvor genannten Probleme anzugehen, um Fortschritte bei der Anwendung dieser neuen Techniken auf HD zu erzielen. Zuvor berichtete HDBuzz, dass eine Gruppe von Forschern aus Spanien ein neues Zinkfinger-Medikament getestet hatte, das in einer Kurzzeitstudie einige positive Auswirkungen in einem Mausmodell von HD zeigte (http://en.hdbuzz.net/103).

Kürzlich entwarf und testete dasselbe Forschungsteam – unter der Leitung von Mark Isalan, der sich jetzt am Imperial College in London, Großbritannien, aufhält – eine aktualisierte Version ihres Medikaments, um zu sehen, ob sie seine Wirkung über einen längeren Zeitraum verstärken und die schädliche Immunantwort im Gehirn reduzieren könnten, die mit der Verabreichung des Medikaments mit AAV’s verbunden ist.

Nach einigen intensiven biochemischen Basteleien konnten Isalan und seine Kollegen zeigen, dass ihr neuer und verbesserter Zinkfinger-Kandidat bei der Reduzierung des schädlichen mutierten Huntingtin-Proteins wirksamer war als ihre vorherige Version, länger anhielt, selektiver bei der gezielten Ausrichtung nur auf das HD-Gen war und ein viel besseres Sicherheitsprofil aufwies als ihre vorherige Version.

Dies sind in der Tat sehr aufregende Ergebnisse und allesamt positive Schritte nach vorn, um die Zinkfingertherapie zu einer praktikablen Option für die Behandlung von menschlicher HD zu machen! Diese langsame, geduldige Arbeit mit Zinkfingern ähnelt dem, was mit ASO-Medikamenten geschah, die einen jahrelangen Vorsprung gegenüber Genomeditierungswerkzeugen haben.

Was ist mit CRISPR?

Obwohl die CRISPR-Technologie als die präziseste Methode zur Durchführung der Genomeditierung gilt, ist sie immer noch der Neuling und Wissenschaftler hatten viel weniger Zeit, die Feinheiten im Vergleich zu den anderen Techniken auszubügeln.

In einem aufregenden Fortschritt bei der Nutzung von CRISPR als therapeutische Option bei HD entwickelte ein Team von Forschern unter der Leitung von Jong-Min Lee am Massachusetts General Hospital kürzlich ein CRISPR-Konstrukt, das selektiv die mutierte, aber nicht die Wildtyp-Kopie des HD-Gens in Zellen in einer Petrischale herausschneiden kann. Sie nutzten die hochspezifische Targeting-Fähigkeit von CRISPR und konnten behandelte Zellen anweisen, das mutierte HD-Gen herauszuschneiden, während sie die gesunde Kopie intakt ließen.

Natürlich ist es eine Sache zu zeigen, dass ein Medikament in Zellen in einer Petrischale wirksam ist, und eine ganz andere Sache zu zeigen, dass es wirksam sein kann, wenn es in einem lebenden Organismus getestet wird. Dies gilt insbesondere für Techniken wie CRISPR – soweit wir heute wissen, benötigen wir ein Virus, um die Anweisungen an jede unserer 100 Milliarden Gehirnzellen zu übermitteln, um jede von ihnen vor den Auswirkungen des mutierten HD-Gens zu retten.

Ein weiteres Risiko besteht darin, dass CRISPR und andere Genomeditierungswerkzeuge die DNA dauerhaft verändern. Dies unterscheidet sich von Medikamenten wie ASOs, die schließlich aus dem Gehirn entfernt werden, was bedeutet, dass ihre Wirkung mit der Zeit nachlässt, wenn sie nicht erneut verabreicht werden.

Zuerst scheint diese Idee fantastisch! Wenn wir HD mit nur einer einzigen Behandlung heilen könnten, würden wir es sicherlich lieben, dies tun zu können. Wir sind uns jedoch immer noch unsicher über die langfristigen Auswirkungen, die mit dem dauerhaften Löschen des HD-Gens und der Reduzierung der Menge an Huntingtin-Protein verbunden sind, das erzeugt wird, unabhängig davon, ob es mutiert ist oder nicht. Es besteht die Möglichkeit, dass das dauerhafte Löschen des HD-Gens zu einigen schwerwiegenden Gesundheitsproblemen einer anderen Art führen könnte, die später auftreten, und wir werden viel Zeit damit verbringen müssen, seine Auswirkungen zu untersuchen, bevor wir wissen, ob es sicher sein wird.

Was kommt als Nächstes?

Es gibt noch viel zu tun, bevor Genomeditierungstechniken wie Zinkfinger und CRISPR-Behandlungen zu praktikablen Optionen für die Huntington-Krankheit werden, aber die hier vorgestellte Forschung zeigt, dass wir einige wichtige Schritte zur Erreichung dieses Ziels unternommen haben.

Während die jüngste Arbeit zeigt, dass die Zinkfingertherapie in einem Mausmodell von HD wirksam ist – dessen Gehirn kleiner als ein Dime ist – wird es viel schwieriger sein zu zeigen, dass sie beim Menschen wirksam sein kann, dessen Gehirn viel größer und komplexer ist und viele andere Herausforderungen zu bewältigen sind. Die CRISPR-Therapie wird wahrscheinlich noch mehr Zeit in Anspruch nehmen, da wir erst jetzt an dem Punkt angelangt sind, an dem wir Pläne machen können, um ihre Wirksamkeit in Mausmodellen von HD zu testen.

Dies ist jedoch kein Grund, sich entmutigen zu lassen, und tatsächlich sind wir der Meinung, dass das Gegenteil der Fall ist! Das Aufregendste an der aktuellen Forschung ist, dass sie zeigt, dass wir mehrere Pfeile im Köcher haben, während wir versuchen, eine Huntingtin-senkende Behandlung für HD zu entwickeln. Selbst wenn sich herausstellt, dass eine Option nicht so funktioniert, wie wir es uns erhofft haben, machen wir stetige Fortschritte bei der Entwicklung neuer Therapien, die möglicherweise auch wirksame Behandlungen für HD bieten.

Diese Idee ist eine, die viele schnell zu verstehen beginnen – kürzlich haben sich zwei Pharmaunternehmen, Sangamo Biosciences und Shire Pharmaceuticals, zusammengeschlossen, um ihre Bemühungen bei der Entwicklung einer Zinkfingerbehandlung als therapeutische Option für die Huntington-Krankheit zu beschleunigen. Obwohl es eine Weile dauern wird, die Feinheiten auszubügeln, stellen wir uns vor, dass es nur eine Frage der Zeit sein wird, bis dasselbe für CRISPR gilt. Persönlich sind wir der Meinung, dass die bisher erzielten Fortschritte uns viel Grund zur Freude geben!

Mehr erfahren

• Originalstudie von Lee und Kollegen, die die spezifische Stilllegung des mutierten HD-Gens mithilfe von CRISPR in Zellen von HD-Patienten beschreibt. (Der vollständige Artikel ist kostenpflichtig oder erfordert ein Abonnement)
• Originalstudie von Isalan und Kollegen, die ihre Arbeit zur Verbesserung von Zinkfinger-Virusbehandlungen in HD-Mausmodellen beschreibt (Open Access)
• Eine nette Animation, die beschreibt, wie CRISPR es Wissenschaftlern ermöglicht, DNA zu editieren