Ein Schritt weiter für die Genom-Bearbeitung: CRISPR-Cas9 und die Huntington-Krankheit

CRISPR-Cas9 ist eine experimentelle Methode der Genom-Bearbeitung, bei der präzise Änderungen an der DNA vorgenommen werden. Zum ersten Mal haben Wissenschaftler diesen Ansatz genutzt, um das mutierte Huntington-Gen in den Gehirnzellen von Mäusen zu verändern. Weitere Wissenschaftler sind dabei, CRISPR-Cas9 zu modifizieren, um es effizienter, spezifischer und sicherer zu machen. Es bleibt ein langer Weg bis zur Nutzung bei Huntington-Patienten, aber die Anwendung bei Mäusen ist schon ein aufregender Schritt nach vorne.

Genom-Bearbeitung mit CRISPR-Cas9

DNA ist die fundamentale Information, die das Wachstum und die Funktionsweise lebender Zellen definiert. Unsere Fähigkeit, diese Information zu manipulieren – die einst nur in Science-Fiction vorkam – treibt die Forschung an Erbkrankheiten wie der Huntington-Krankheit nun voran. Die Entwicklung und Anwendung von Werkzeugen, die die DNA verändern, bezeichnet man als Genom-Bearbeitung (Engl.: gene / genome editing) und eines der Werkzeuge, das in letzter Zeit viel Aufmerksamkeit bekam, heißt CRISPR-Cas9. Seit seiner Einführung gibt es Forschungen im Bereich der Anwendbarkeit auf die genetische Mutation der Huntington-Krankheit.

Es handelt sich um eine experimentelle Methode, die noch nicht für die Behandlung von Menschen geeignet ist, die sich aber schnell vom Reagenzglas über lebende Zellen bis hin zu lebenden Organismen weiterentwickelt hat. Neuere Forschungsarbeiten einiger Gruppen zeigen, dass CRISPR-Cas9 genutzt werden kann, um das mutierte Huntington-Gen im Gehirn lebender Mäuse zu verändern. Und, was noch vielversprechender ist, die Ergebnisse eines der Labore zeigen ein verbessertes Verhalten von Huntington-Mäusen nach der Anwendung von CRISPR-Cas9 auf die Gehirnzellen. Diese Technologie der Genom-Bearbeitung wird immer weiter verfeinert und mehrere Huntington-Forscherteams sind dabei sie auf die Herausforderungen bei der Huntington-Therapie zuzuschneidern. Wir wollen nun erklären, wie CRISPR-Cas9 funktioniert, wie es in der Huntington-Krankheit angewendet werden könnte und warum zum aktuellen Zeitpunkt auch die Risiken berücksichtigt werden.

Das Huntington-Gen: Das Handbuch neu schreiben

Die Huntington-Krankheit wird durch eine ungewollte Verlängerung unseres genetischen Codes verursacht. Milliarden biologischer Bausteine, die Nukleotide C, G, A und T befinden sich in diesem DNA code. Sie werden in Gruppen ausgelesen und interpretiert – in Abschnitten der Gene, die sich Exone nennen. Man kann sich ein Nukleotid als einen Buchstaben vorstellen, drei Nukleotide wären dann ein Wort, ein Exon ein Satz, das Gen ein Absatz und das vollständige Genom ein Handbuch, dass alle Bestandteile beschreibt, die eine Zelle zum Wachsen und Funktionieren benötigt.

Wir wollen uns einen Paragraphen des Handbuches genauer betrachten, nämlich das Gen, das die Huntington-Krankheit verursacht. In Menschen, die die Krankheit in sich tragen, enthält der erste Satz des Paragraphs einen Fehler: einen Abschnitt aus C-A-G Buchstaben, der sich wiederholt … und wiederholt … und wiederholt … viel, viel öfter als nötig. Was wäre, wenn wir diesen Fehler bearbeiten könnten und all die überflüsssigen Wiederholungen streichen? Darauf liegt das Hauptaugenmerk bei der Genom-Bearbeitung in der Huntington-Forschung und CRISPR-Cas9 ist einer von mehreren Ansätzen.

CRISPR-Cas9: richtig zuschneiden

Ein Handbuch kann durch ein Textbearbeitungsprogramm umgeschrieben werden. Bei der Bearbeitung von Genen, die Zelle für Zelle durchgeführt werden muss, muss die fehlerhafte Abfolge zunächst gefunden und dann physisch herausgeschnitten werden – genau das mach CRISPR-Cas9. Dafür benötigt es zwei Bestandteile: (1) eine wegweisende RNA und (2) ein schneidendes Enzym, genannt Cas9. Es gibt eine einfache Analogie: stellen Sie sich vor, Sie möchten ein Band durchschneiden, aber nur eine andere Person darf die Schere benutzen. Sie würden vielleicht das Band mit zwei Händen straff ziehen und der Person genau zeigen, wo geschnitten werden soll. So funktioniert CRISPR-Cas9 im mikroskopischen Bereich: die anleitende RNA findet die richtige Stelle der DNA und zeigt sie an, Cas9 wirkt dann wie eine Schere und schneidet zu.

Im Labor haben Wissenschaftler spezifische wegweisende RNAs entwickelt, die Cas9 zeigen, wo geschnitten werden soll und zwar je ein mal an beiden Seiten der extralangen C-A-G Wiederholung des Huntington-Gens. Die neuen Enden können dann zusammengefügt werden, sodass der schädliche Teil dauerhaft entfernt wird. So verwenden Wissenschaftler CRISPR-Cas9, um Genabschnitte zu bearbeiten.

So wie bei jeder aufregenden neuen Technologie, haben die Forscher auch mit CRISPR-Cas9 experimentiert, um neue Arten seiner Nutzung zu finden. Frühzeitig wurde festgestellt, dass einfache Schnitte in einem bestimmten Gen recht leicht gesetzt werden können. Jedoch ist der Reparaturprozess des Gens durch die Zelle oft fehlerhaft und führt dazu, dass winzige Teile der genetischen Information verloren gehen.

Stellen Sie sich vor, Sie sitzen mit einem Freund beim Abendessen und schicken eine SMS mit dem Inhalt: „Gib mir bitte mal das Salz“. Wenn Sie versehentlich den zweiten und dritten Buchstaben vergessen, aber die Wortlänge beibehalten, könnte Ihr Freund folgende Nachricht erhalten: „Gmi rbi ttema lda sSa lzxx“. Wenn genetische Botschaften allerdings derart verschoben werden, reagieren in unseren Zellen Mechanismen, die die Fehler erkennen und dafür sorgen, dass der Inhat ignoriert wird. Dadurch haben Forscher auch die Möglichkeit mithilfe von CRISPR-Cas9 ein Gen effektiv zu löschen, statt den betroffenen Abschnitt ganz exakt bearbeiten zu müssen.

CRISPR-Cas9 im Gehirn von Huntington-Mäusen

Mehrere Forschungsgruppen haben herausgefunden, dass es möglich ist, das Huntington-Gen im Gehirn lebender Mäuse zu bearbeiten. Kürzlich hat ein Team, das von Xiao-Jiang Li an der Emory University in den USA geleitet wird, herausgefunden, dass schon das Verursachen kleiner Schnitte im Huntington-Gen günstige Auswirkungen auf die Huntington-Mäuse haben könnte. Sie haben CRISPR-Cas9 zum Löschen des mutierten Huntington-Gens verwendet, statt zum Bearbeiten bzw. Verkürzen des verlängerten Abschnittes.

Um CRISPR-Cas9 in einer Huntington-Maus einzusetzen, werden die wegweisende RNA und die Cas9-„Schere“ mithilfe von speziell entwickelten Viren transportiert, die in das Gehirn injiziert werden. Li’s Gruppe hat diese Technik auf das Striatum angewendet, ein Areal im Gehirn, das Stimmungen und Bewegungen kontrolliert und das durch die Huntington-Krankheit beschädigt wird. Ein paar Wochen später hatten sich die CRISPR-Cas9 Bestandteile auf viele Zellen verteilt und das mutierte Huntington-Gen ausgeschaltet. Anzeichen der Belastung der Gehirnzellen nahmen ab.

Nach drei Monaten befanden sich weniger schädliche Verklumpungen von Huntingtin in den Gehirnzellen und die Mäuse zeigten bessere Ergebnisse bei Untersuchungen ihrer Bewegungen. Das Erstaunlichste war, dass sich auch ältere Mäuse erholten, die bereits Symptome gezeigt hatten. Sogar neun Monate alte Mäuse (das ist ca. die Hälfte der Lebenserwartung), zeigten ein gesünderes Verhalten nach der Behandlung, was nahelegt, dass sich ihre Gehirne teilweise erholen konnten, obwohl ihnen schon über lange Zeit Schaden zugefügt worden war.

Vorsichtig weitermachen

Die meisten Huntington-Betroffenen haben nur eine mutierte Kopie des Huntington-Gens, während die zweite Kopie völlig gesund ist. Es gibt Bedenken, CRISPR-Cas9 als Therapie einzusetzen, denn es könnte neben dem schädlichen Gen auch Teile des gesunden zerstören. Die Gruppe von Li hat auch Experimente durchgeführt, um dieser Frage indirekt nachzugehen. Sie haben mit Mäusen gearbeitet, die zwei mutierte Kopien des Gens in sich trugen und CRISPR-Cas9 eingesetzt, um beide zu entfernen. Es konnten keine sofortigen Schäden bei den Mäusen erkannt werden, sie wurden für einige Wochen beobachtet.

Die Unbedenklichkeit bei der Beeinflussung der gesunden Kopie des Huntington-Gens ist wichtig, wenn man an die laufende klinische Studie mit Huntingtin-vermindernden ASOs denkt. Diese Medikamente verringern die Eiweißproduktion durch sowohl das mutierte als auch das gesunde Huntington-Gen. Forschung an Mäusen lässt vermuten, dass das im weiteren Leben der Mäuse unbedenklich ist, aber es ist schwierig daraus Rückschlüsse zu ziehen, da die Lebensdauer von Mäusen so viel kürzer ist als die von Menschen. Die Firmen, die die ASO-Studie durchführen – Roche und Ionis – sind sich dieser Risiken sehr bewusst und beobachten die Teilnehmer daher sehr aufmerksam hinsichtlich möglicher Anzeichen von Schwierigkeiten.

Es gibt andere zentrale Unterschiede zwischen den ASO-Medikamenten und dem CRISPR-Cas9 Ansatz. Die laufende ASO-Studie am Menschen ist eine Huntingtin-vermindernde oder Gen-Stummschaltungs-Therapie, die beide Kopien des Huntington-Gens für kurze Perioden außer Gefecht setzt. Wenn die Behandlung ausgesetzt wird, wird das Gen seine Funktionsweise wieder erlangen. Im Gegensatz dazu verursacht die Bearbeitung von Genen durch CRISPR-Cas9 eine dauerhafte Veränderung der DNA und muss daher mit noch größerer Vorsicht angegangen werden. Es gibt Nachweise, dass das Huntington-Gen, ob beschädigt oder nicht, wichtige Funktionen in der Zelle inne hat und wir wollen keine bleibenden Schäden verursachen. Die gute Nachricht ist, dass Huntington-Forscher sich darum bemühen, die gesunde Kopie des Gens bei der Therapie außen vor zu lassen. Man spricht hier von allel-spezifischen Ansätzen.

Verbesserte Techniken bei der Genom-Bearbeitung

Zwei Gruppen haben kürzlich die CRISPR-Cas9 Methode so verfeinert, dass nur die mutierte Kopie des Huntington-Gens verändert und damit deaktiviert wird. Eine davon, geleitet von Jong-Min Lee am Massachusetts General Hospital, nützte intelligent entwickelte wegweisende RNAs um eine allel-spezifische Löschung vorzunehmen. Diese RNAs suchten nach winzigen Unterschieden in der Abfolge der DNA Buchstaben in der Nähe der Huntington-Mutation und veranlassten Cas9 zwei Schnitte zu setzen. Mit ihrem neuen Ansatz kann das Genom-Bearbeitungswerkzeug sogar passend zur individuellen DNA „personalisiert“ werden.

Die zweite Gruppen, angeführt von Beverly Davidson am Children’s Hospital of Philadelphia, verwendete einen ähnlichen Ansatz um ausschließlich das mutierte Gen anzupeilen und setzte kleinere Schnitte mit Cas9. Dadurch endete die Produktion des ungewollten Huntingtin-Proteins. Wie Li’s Gruppe gelang es auch ihnen das Huntington-Gen in den Gehirnen lebender Mäuse auszuschalten. Ob eine dieser beiden Techniken auch das Verhalten der Huntington-Mäuse verbessert, muss noch herausgefunden werden, aber beide Innovationen sind ein Schritt nach vorne in Richtung zukünftiger Gentherapien.

Bleibende Herausforderungen bei der Genom-Bearbeitung

Wir freuen uns über die Nutzung der Genom-Bearbeitung zur Verbesserung des Verständnisses der Huntington-Krankheit. Die Verwendung von CRISPR in lebenden Mäusen und die Entwicklung von allel-spezifischen Ansätzen stellen signifikante Fortschritte dar, aber es gibt weiterhin einige Hürden, die überwindet werden müssen, bevor CRISPR-Cas9 als Huntington-Therapie Einsatz finden kann. Hier sind die Hauptherausforderungen, mit denen sich die Wissenschaftler nach dem aktuellen Stand der Technik auseinander setzen müssen:

1. Präzision: sicherstellen, dass CRISPR-Cas9 tatsächlich nur das Gen angreift, für das es entwickelt wurde, und keinen beliebigen Schaden anrichtet. Hier scheinen die Wissenschaftler auf einem guten Weg zu sein.

2. Allel-Spezifität: sicherstellen, dass nur die mutierte Kopie des Gens und nicht die gesunde abgeschaltet wird. Die hier beschriebenen Untersuchungen zeigen auf diesem Gebiet tolle Fortschritte.

3. Transport: das CRISPR-Cas9-Werkzeug in so viele Neuronen (Gehirnzellen) wie möglich zu verteilen, um dort jeweils das mutierte Huntington-Gen abzuschalten. Wir wissen nun, dass das bei Mäusen möglich ist, aber die Herausforderung bleibt die Behandlung des menschlichen Gehirns.

4. Sicherheit der Therapie: sicherstellen, dass die Abschaltung eines Teils des Huntington-Gens keine sofortigen neurologischen Probleme bis hin zum Tod verursacht. Bisher scheint diese Sicherheit gewährleistet zu sein.

5. Langzeitsicherheit: sicherstellen, dass die Bearbeitung des Huntington-Gens auch langfristig unschädlich ist. Diese Frage ist über das Mausmodell schwierig zu beantworten. Es könnten über Experimente mit Primaten Aufschlüsse geben oder auch die Erprobung weniger dauerhafter Therapien in klinischen Studien.

Die Huntingtin-Verminderungs-Studie mit den ASOs befindet sich noch im anfänglichen Stadium, bei dem die Sicherheit überprüft wird. Aber der Ansatz ist bisher vielversprechend. Die Genom-Bearbeitung würde dauerhafte Modifikationen der Informationen in unserem DNA-Code bedeuten, mit tiefgreifenden Folgen. Die unbedenkliche Anwendung von CRISPR-Cas9 gewinnt exponentiell an Wichtigkeit auf ihrem Weg zum Einsatz am Menschen. Nichtsdestotrotz zeigt die neue Generation dieser Technologie unglaubliche Möglichkeiten auf und es sind viele kluge Köpfe dabei, weitere Innovationen anzustoßen.

Erfahren Sie mehr

• Die Originalveröffentlichung zu der Untersuchung an Mäusen durch das Labor von Li (open access)
• Die Originalveröffentlichung zur allelspezifischen Stummschaltung durch das Labor von Lee (full article requires payment or subscription)
• Die Originalveröffentlichung zur allelspezifischen Stummschaltung durch das Labor von Davidson (open access)