Ein Schritt vorwärts für die Genbearbeitung: CRISPR-Cas9 und HD

CRISPR-Cas9 ist eine experimentelle Genbearbeitungstechnik, mit der präzise Veränderungen in der DNA vorgenommen werden. Zum ersten Mal haben Wissenschaftler diesen Ansatz verwendet, um die Huntington-Krankheit-Mutation in den Gehirnzellen einer Maus anzugreifen. Andere Forscher verfeinern CRISPR-Cas9, um es effizienter, spezifischer und sicherer zu machen. Es ist noch ein weiter Weg bis zum Einsatz bei HD-Patienten, aber die Anwendung bei Mäusen ist ein aufregender Schritt nach vorn.

Genbearbeitung mit CRISPR-Cas9

DNA ist der grundlegende Code, der das Wachstum und die Funktion lebender Zellen steuert. Unsere Fähigkeit, diesen Code zu manipulieren, einst Stoff der Science-Fiction, hat begonnen, die Forschung an Erbkrankheiten wie der Huntington-Krankheit voranzutreiben. Das Design und die Anwendung von Werkzeugen zur Veränderung der DNA wird als Genbearbeitung bezeichnet, und ein Werkzeug, das in letzter Zeit Aufmerksamkeit erregt hat, wird CRISPR-Cas9 genannt. Seit seiner Einführung haben HD-Wissenschaftler die Möglichkeit untersucht, dass CRISPR-Cas9 verwendet werden könnte, um die genetische Mutation, die HD verursacht, herauszuschneiden.

Diese experimentelle Technik ist noch nicht bereit, an Menschen ausprobiert zu werden, aber sie hat sich schnell von Reagenzgläsern über lebende Zellen zu Organismen entwickelt. Jüngste Arbeiten von mehreren Forschungsgruppen haben gezeigt, dass CRISPR-Cas9 verwendet werden kann, um das HD-Gen im Gehirn einer lebenden Maus zu bearbeiten. Noch aufregender ist, dass die neuesten Ergebnisse eines Labors eine verbesserte HD-Mausverhalten zeigen, nachdem CRISPR-Cas9 ins Gehirn eingebracht wurde. Diese Genbearbeitungstechnologie wird immer ausgefeilter, und mehrere HD-Forschungsteams passen sie an die Herausforderungen der HD-Therapie an. Sprechen wir darüber, wie CRISPR-Cas9 funktioniert, seine Anwendung auf HD und warum Sicherheit in diesem Stadium ein Problem darstellt.

Das HD-Gen: Die Geschichte bearbeiten

HD wird durch eine unerwünschte Ergänzung des genetischen Codes verursacht. Milliarden von biologischen Bausteinen, die Nukleotide C, G, A und T, finden sich im vollständigen DNA-Code. Diese Nukleotide werden in Blöcken gelesen und interpretiert – Abschnitte des Gens, die als Exons bekannt sind. Sie können sich ein Nukleotid als einen Buchstaben vorstellen, drei Nukleotide als ein Wort, ein Exon als einen Satz, das Gen als einen Absatz und das vollständige Genom als eine Bedienungsanleitung, die alle Teile beschreibt, die für das Wachstum und die Funktion von Zellen benötigt werden.

Zoomen wir auf einen Absatz der Geschichte, das Gen, das HD verursacht. Bei Menschen, die dazu bestimmt sind, HD zu entwickeln, enthält der erste Satz einen Fehler: eine Kette von C-A-G-Buchstaben, die immer weiter geht… und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter und immer weiter… viel öfter als nötig. Was wäre, wenn wir den CAG-Repeat-Fehler bearbeiten könnten, wie das Löschen all dieser zusätzlichen „immer-weiter“-Wiederholungen aus dem vorherigen Satz? Dies ist der Hauptfokus der Genbearbeitung in der HD-Forschung, und CRISPR-Cas9 ist einer von mehreren Ansätzen.

CRISPR-Cas9: Den Schnitt machen

Es gibt kein Äquivalent zu Textverarbeitungssoftware, um Gene zu bearbeiten. Um Gene auf mikroskopischer Ebene zu reparieren, eine Zelle nach der anderen, muss der fehlerhafte Code lokalisiert und physisch geschnitten werden – und das ist es, was CRISPR-Cas9 tut. Dieses Schneiden erfordert zwei Komponenten: (1) eine Guide-RNA und (2) ein Schneideenzym namens Cas9. Hier ist eine einfache Analogie: Stellen Sie sich vor, Sie möchten ein Stück Band schneiden, aber Ihr Freund hat die Schere. Sie könnten das Band mit zwei Händen festhalten und festziehen, um Ihrem Freund genau zu zeigen, wo er schneiden soll. Das ist CRISPR-Cas9, auf mikroskopischer Ebene: Die Guide-RNA findet und präsentiert die richtige Stelle auf der DNA, und die Cas9 fungiert als Schere und schneidet die DNA tatsächlich.

Im Labor können Wissenschaftler spezifische Guide-RNAs entwerfen, die Cas9 zeigen, wo zweimal geschnitten werden soll, auf beiden Seiten des extra langen Abschnitts von C-A-G-Wiederholungen im HD-Gen. Dann können die neuen Enden zusammengefügt werden, wodurch der anstößige Teil dauerhaft entfernt wird. So verwenden Wissenschaftler CRISPR-Cas9, um genetische Sequenzen zu bearbeiten.

Wie bei jeder aufregenden neuen Technologie haben Forscher mit dem CRISPR-Cas9-System gespielt, um neue Wege zur Nutzung des Werkzeugs zu entdecken. Schon früh erkannten die Forscher, dass sie CRISPR-Cas9 verwenden könnten, um ziemlich einfach einzelne Schnitte in einem bestimmten Gen zu machen. Der Reparaturprozess, den Zellen verwenden, um diese Schnitte zu reparieren, ist fehleranfällig und führt häufig dazu, dass winzige Teile der genetischen Information verloren gehen.

Stellen Sie sich als Analogie vor, Sie würden am Esstisch eine SMS an einen Freund tippen, in der steht: „Bitte gib die Butter weiter“. Wenn Sie versehentlich ein paar Buchstaben übersprungen haben – sagen wir „le“ – aber die Struktur der Nachricht beibehalten haben, würde Ihr Freund Folgendes erhalten: „pasepa ssth ebu tterxx“. Wenn genetische Botschaften mit kleinen Löschungen wie dieser durcheinander geraten, verfügen Zellen über Mechanismen, um die Fehler zu erkennen und ihren Inhalt zu ignorieren. Dies gibt Forschern die Möglichkeit, CRISPR-Cas9 zu verwenden, um ein Gen effektiv zu löschen, anstatt die Sequenz auf spezifischere Weise zu bearbeiten.

CRISPR-Cas9 im HD-Mausgehirn

Ein paar Forschungsgruppen haben gerade entdeckt, dass es möglich ist, das HD-Gen im Gehirn einer lebenden Maus zu bearbeiten. Vor kurzem fand ein Team unter der Leitung von Xiao-Jiang Li, der an der Emory University in den USA arbeitet, heraus, dass winzige Schnitte im HD-Gen positive Auswirkungen auf HD-Mäuse haben könnten. Für diese Experimente verwendeten sie CRISPR-Cas9 im Löschmodus, anstatt das HD-Gen zu bearbeiten, um das lange C-A-G durch ein kurzes zu ersetzen.

Um CRISPR-Cas9 in einer HD-Maus zu verwenden, werden die Guide-RNA und die Cas9-„Schere“ von speziell entwickelten Viren getragen, die in das Gehirn injiziert werden müssen. Lis Gruppe wandte diese Technik auf das Striatum an, einen Gehirnbereich, der Stimmung und Bewegung steuert und während der HD geschädigt wird. Einige Wochen später hatten sich die CRISPR-Cas9-Komponenten auf viele Zellen ausgebreitet, das dysfunktionale HD-Gen deaktiviert und die Anzeichen von Stress auf den Neuronen hatten abgenommen.

Nach drei Monaten gab es weniger schädliche Ansammlungen von Huntingtin-Protein in den Gehirnzellen, und die HD-Mäuse hatten sich bei Bewegungstests etwas verbessert. Der aufregendste Aspekt dieses Experiments war die Erholung älterer Mäuse, die bereits Symptome entwickelt hatten. Sogar 9 Monate alte Mäuse (etwa im mittleren Alter) verbesserten sich nach den Injektionen, was darauf hindeutet, dass sich ihr Gehirn nach einem halben Leben voller Schäden teilweise erholen könnte.

Mit Vorsicht vorgehen

Die meisten Menschen mit HD haben nur eine Kopie des mutierten Gens und eine andere Kopie, die vollkommen gesund ist. Es gibt einige Bedenken hinsichtlich der Verwendung von CRISPR-Cas9 als Therapie, da es zwar den beschädigten Teil aus dem HD-Gen löschen könnte, aber auch dauerhaft einen Teil der gesunden Kopie entfernen könnte. Das Li-Labor führte auch einige Experimente durch, um diese Frage indirekt anzugehen, indem es mit Mäusen arbeitete, die zwei fehlerhafte Kopien des HD-Gens hatten, und CRISPR-Cas9 verwendete, um beide zu entfernen. Es bestand keine unmittelbare Gefahr für die Mäuse, obwohl sie nur wenige Wochen lang überwacht wurden.

Die Sicherheit der Beeinträchtigung der normalen Kopie des HD-Gens ist wichtig, angesichts der laufenden klinischen Studie eines Huntingtin-senkenden ASO. Das Medikament reduziert den Spiegel sowohl der mutierten als auch der gesunden Kopie des HD-Gens. Einige Forschungsergebnisse an Mäusen haben gezeigt, dass dies im späteren Leben harmlos ist, aber es ist schwer, sicher zu sein, da die Lebensdauer einer Maus viel kürzer ist als die eines Menschen. Die Unternehmen, die die ASO-Studie durchführen – Roche und Ionis – sind sich dieser Risiken bewusst und überwachen die Probanden in der Studie sorgfältig auf Anzeichen von Problemen, die durch die Senkung des HD-Gens verursacht werden.

Es gibt andere wichtige Unterschiede zwischen ASO-Medikamenten und dem CRISPR-Cas9-Ansatz. Die aktuelle ASO-Studie am Menschen ist eine Huntingtin-Senkung oder Gen-Stilllegung-Therapie, die darauf abzielt, beide Kopien des HD-Gens in kurzen Schüben zu deaktivieren. Wenn die Behandlung gestoppt wird, wird das Gen seine Funktion wiedererlangen. Umgekehrt erzeugt die Gen-Bearbeitung mit CRISPR-Cas9 eine dauerhafte Veränderung der DNA und muss daher mit noch mehr Vorsicht angegangen werden. Es gibt Beweise dafür, dass das HD-Gen, ob beschädigt oder nicht, wichtige Funktionen in der Zelle hat, und wir wollen keine dauerhaften Nebenwirkungen riskieren. Die gute Nachricht ist, dass HD-Wissenschaftler die Herausforderung angehen, die gesunde Kopie des Gens zu vermeiden, bekannt als ein allelspezifischer Ansatz.

Verbesserung der Genbearbeitungstechniken

Zwei Gruppen haben kürzlich die CRISPR-Cas9-Technik verbessert und sie verwendet, um nur die beschädigte Kopie des Gens zu schneiden und zu inaktivieren. Ein Team unter der Leitung von Jong-Min Lee am Massachusetts General Hospital nahm eine allelspezifische Deletion mit clever entworfenen Guide-RNAs vor. Die Guides suchten nach winzigen Diskrepanzen in den DNA-Buchstaben in der Nähe der HD-Mutation und lenkten zwei Cas9-Schnitte. Ihr Ansatz ist neuartig, da Genbearbeitungen je nach der DNA einer Person „personalisiert“ werden könnten.

Eine zweite Gruppe unter der Leitung von Beverly Davidson am Children’s Hospital of Philadelphia verwendete einen ähnlichen Ansatz, um nur auf das mutierte Gen abzuzielen und kleinere Schnitte mit Cas9 zu machen. Dies stoppte die Produktion mehrerer schädlicher Huntingtin-Proteine. Wie Lis Gruppe konnten sie auch das HD-Gen im Gehirn einer lebenden Maus inaktivieren. Ob eine der beiden aktualisierten CRISPR-Techniken das Verhalten einer HD-Maus verbessern wird, bleibt abzuwarten, aber beide Innovationen sind ein Schritt in Richtung der Gentherapien der Zukunft.

Herausforderungen für die Genbearbeitung

Wir freuen uns über die Verwendung der Genbearbeitung, um HD besser zu verstehen. Die Verwendung von CRISPR in einer lebenden Maus und die Entwicklung allelspezifischer Ansätze stellen bedeutende Fortschritte dar, aber es gibt mehrere Hürden zu überwinden, bevor CRISPR-Cas9 zu einer HD-Behandlung entwickelt werden kann. Hier sind die wichtigsten Herausforderungen, vor denen Forscher stehen, und unser aktueller Wissensstand:

1. Präzision: Sicherstellen, dass die Cas9 nur das Gen schneidet, für das sie entwickelt wurde, und nicht anderswo zufälligen Schaden anrichtet. Wissenschaftler scheinen auf dem besten Weg zu sein, sicherzustellen, dass CRISPR sehr spezifisch ist.

2. Allelspezifität: Sicherstellen, dass nur die mutierte Kopie des HD-Gens und nicht die gesunde entfernt wird. Die Forschung, die wir hier beschrieben haben, ist ein aufregender Schritt nach vorn.

3. Verabreichung: Sicherstellen, dass die CRISPR-Cas9-Maschinerie in viele Neuronen im Gehirn eindringt und das HD-Gen aus jedem entfernt. Jetzt wissen wir, dass es in einer Maus möglich ist, aber es bleibt eine große Hürde für jede Therapie, die zur Behandlung des menschlichen Gehirns eingesetzt wird.

4. Kurzfristige Sicherheit: Sicherstellen, dass das Löschen eines Teils des HD-Gens keine unmittelbaren neurologischen Probleme oder sogar den Tod verursacht. Bisher scheint dies der Fall zu sein.

5. Langfristige Sicherheit: Sicherstellen, dass die Bearbeitung des HD-Gens über einen langen Zeitraum sicher wäre. Dies ist eine sehr schwierige Frage, die an Mäusen zu untersuchen ist. Wir können Antworten durch Primatenexperimente oder durch weniger dauerhafte Techniken in klinischen Studien finden.

Die Huntingtin-senkende ASO-Studie befindet sich noch in frühen Sicherheitsphasen, aber der Ansatz hat bisher vielversprechend gezeigt. Die Genbearbeitung könnte dauerhafte Veränderungen an dem einführen, was im DNA-Code geschrieben steht, mit tiefgreifenden Konsequenzen. Die sichere Verwendung von CRISPR-Cas9 wird exponentiell schwieriger, je näher es an die Klinik rückt. Dennoch zeigt die nächste Generation dieser Technologie unglaubliches Potenzial, und viele Köpfe bringen sie auf innovative Weise voran.

Mehr erfahren

• Originalmanuskript, das die Arbeit mit Mäusen aus dem Li-Labor beschreibt (Open Access)
• Originalmanuskript, das die Arbeit aus dem Lee-Labor über allelspezifische Stilllegung beschreibt (vollständiger Artikel erfordert Bezahlung oder Abonnement)
• Originalmanuskript, das die Arbeit aus dem Davidson-Labor über allelspezifische Stilllegung beschreibt (Open Access)